En esta entrevista, Ghaith Hamza de AstraZeneca habla con Life Sciences News-Medical sobre los conceptos básicos de la espectrometría de masas asistida por molde asistida por afinidad (Affi-BAMS) y cómo Affi-BAMS puede apuntar a proteínas expresas para programas proteómicos
Los principales espacios de curación de AstraZeneca giran en torno a las terapias oncológicas, cardiovasculares, renales, metabólicas y respiratorias; sin embargo, también estamos desarrollando proyectos dirigidos a oportunidades dirigidas a autoinmunidad, enfermedades infecciosas y neurología.
El Departamento R
La rama de Discovery Science opera dentro de la R
Nuestras pinturas de descubrimiento de objetivos se centran en la deconvolución de objetivos, el combate de objetivos, la selectividad y el perfil de objetivos remotos. Para facilitar esto, utilizamos una serie de análisis para caracterizar nuestros objetivos, que van desde antenas químicas hasta matrices de afinidad de círculos de parientes, análisis de movimiento térmico celular. y proteómica general.
Nuestras pinturas multi-OMIC se centran en la traducción clínica, aprovechando la fuerza de la proteómica clínica cuantitativa a gran escala. Aquí, integramos conjuntos de conocimientos con varias tecnologías OMIC para mejorar los mecanismos de la enfermedad; caracterizar modelos preclínicos y muestras clínicas de pacientes para estratificar mejor a los pacientes, así como nuestros modelos preclínicos.
Finalmente, la organización de la degradación de proteínas se concentra en la validación del objetivo y los usos curativos. Aquí utilizamos un conjunto de análisis de degradación y enlace de especificaciones para concentrarnos en la tasa de renovación de proteínas y la expresión de proteínas mientras los sistemas PROTAC.
Flujo de trabajo de espectrometría de masas asistida por moldeo por afinidad
Affinity-Moulding ayudó a manipular la espectrometría de masas (Affi-BAMS) con la fuerza de 3 técnicas analíticas principales: utilizamos perlas magnéticas que pueden enriquecer los objetivos de proteínas en un montón de muestras y chips de ADN para mover o enriquecer los objetivos, y este chip se enjuaga con un MALDI solución matricial Esto luego termina formando una micro-red muy uniforme que se puede llevar a cualquier espectrómetro de masas con una fuente MALDI.
Usando este enfoque, podemos generar una bola soltera en una micro-red que captura un objetivo soltero, y podemos moverla a un pozo soltero. Es una plataforma de red de cuentas magnéticas de alta velocidad diseñada para el análisis de proteínas dirigido, y aplicamos esta estrategia a través de los 3 pilares en ejecución dentro de la organización de Biología Química y Proteómica para ayudarnos con nuestros esfuerzos de R.
El flujo de trabajo de Affi-BAMS es muy simple. Podemos extraer proteínas de cualquier muestra biológica, ya sean muestras de tejido, biofluidos o células; siempre que sus proteínas puedan extraerse, podemos divulgarlas para la proteólisis de una variedad de otras proteasas, generando péptidos que contienen epítopos expresos.
Estos epítopos pueden ser anticuerpos dirigidos covalentemente conectados a perlas magnéticas antes de ser colocados en esta micro-red. Con este enfoque, podemos dar forma a una micro-red muy unishape que se puede llevar a una herramienta MALDI-TOF para la extracción y cuantificación del blanco.
Hay dos elementos clave en este proceso. Se utiliza un elastómero para registrar cada una de las juntas de cada pozo. Estos moldes de forjado de anuncios se exponen luego a una solución altamente orgánica y altamente ácida que contiene una matriz MALDI. Entonces es posible enjuagar nuestros objetivos y colindar con los péptidos enjuagados del objetivo en el pozo. La matriz cristaliza formando pequeños sitios muy uniformes.
Esencialmente, podemos eliminar las formaciones cristalinas anormales que ocurren naturalmente en las matrices MALDI. Cada antena se valida por adelantado, una vez. A medida que se validan el anticuerpo y el enriquecimiento, es imaginable tropezar con espectros MALDI-TOF en una fecha posterior.
Affi-BAMS es una plataforma dirigida que se puede utilizar en muchos otros análisis o aplicaciones. Un ejemplo de ello es la cuantificación de SILAC, y un ejemplo de un examen utilizó dos inhibidores de quinasas: estaurosporina y SU11274. El objetivo de interés en este ejemplo fue C- MET, y los estudios descubrieron que hubo una minimización significativa en las situaciones de fosforilación con el remedio SU, mientras que se observó un ligero mínimo con el remedio ST, esencialmente, estaurosporina en comparación con el control, lo que resultó corresponder a un Western blot de la misma experiencia.
Un mérito clave de Affi-BAMS es que utiliza la masa como una capa de momento de cuantificación. Es ideal para programas que tienen varias modificaciones (como el caso de RPS6 en su cola c-terminal, donde está fuertemente fosforilado) esas situaciones no serían visuales en un Western blot normal. Sin embargo, debido a que la cuantificación se resuelve a través de la masa, es imaginable notar y cuantificar cada una de las especies de fosforilación en un patrón que contiene un péptido RPS6.
También es posible adoptar una investigación muy específica de la carretera. Otro ejemplo, un experimento SILAC en células MKN45 tratadas con rapamicina, se refería a un objetivo de mTOR. Este ejemplo, pensado como el uso de una investigación multiplexada en la que cada corte enriquece un objetivo no casado, pero pudimos cuantificar cada uno de los objetivos en esta investigación.
Aquí, se descubrió que la fosforilación de mTOR minimiza, y además de los objetivos posteriores de mTOR 4EBP y RPS6, el estado de fosforilación también se minimiza significativamente. Los grados de AKT fueron particularmente interesantes, y como expresión general más alta, mientras que 4EBP más alto ligeramente. y un T46 en 4EBP, descubrimos un mínimo dramático en la forma de doble fosforilo, mientras que en la forma de fosforilo innegable, descubrimos un ligero aumento. Este es un ejemplo inteligente de cómo podemos configurar repeticiones multiplexadas para su camino de selección mientras estamos capaz de diseccionar la biología de una manera compleja.
Blade listo para micro-red BAMS ™
Muy útil. Podemos pintar con concentraciones absolutas mediante el uso de la cuantificación SISCAPA. Recientemente terminamos un plasma biofluido y lo diseñamos generando dos curvas: la curva delantera y la trasera. En la curva delantera, rango la concentración suave y fijamos la concentración superior de el péptido Mientras tanto, en la curva opuesta, variamos la concentración superior del péptido y fijamos la concentración de suave.
Cuando analizamos los resultados, la curva opuesta nos mostró la diversidad dinámica de investigación para este péptido expreso que cruzó varios órdenes de magnitud, ya que la restricción de detección y la restricción de cuantificación, la curva frontal mostró la concentración del analito.
Al emplear el análisis dirigido, podemos apuntar a proteínas de interés y observar la elegancia de las mutaciones puntuales que ocurren en la resistencia a los medicamentos, y podemos apuntar a esas proteínas expresas con mutaciones puntuales, rastreando cómo esto se traduce en resistencia a los medicamentos.
Nuevamente, como se trata de una plataforma dirigida, podemos buscar péptidos generados en la fórmula biológica a través de otras enzimas o sheddasas, rastreando bien otras actividades de sheddase. Por ejemplo, cuando se ejecuta con un beta-amiloide del líquido cefalorraquídeo indigerido, el moldeado Los multiplex pueden ser bien utilizados porque el epítopo se conserva en la diversidad de fragmentos de péptidos generados. Podemos extraer limpiamente muchos fragmentos, separando las muestras en mal estado y sanas. Podemos utilizar esta estrategia para percibir cómo este procedimiento se traduce en biología aplicable.
Kits BAMS ™
Podemos utilizar esta técnica cuando se ejecuta con epigenética para expresar histonas. Por ejemplo, la histona 3 se modifica mucho empleando una variedad de cambios postraduccionales. En un estudio reciente, probamos una línea móvil U2OS que había sido tratada con un inhibidor de HDAC Construimos movimientos de acetilación en histonas, digerimos muestras y tratamos muestras con quimotripsina, generando al final un atractivo espectro de masas.
Usando este espectro, podemos simplemente concentrarnos en un pico y usarlo como un pico de referencia para normalizar entre las dos muestras. A partir de ahí, leemos acerca de varios picos, ordenando dos de ellos. Finalmente, leemos acerca de la diafonía postraduccional de la enmienda que está sucediendo en las histonas y la tradujo en fenotipo (una lectura biológica) para ver cómo los ajustes epigenéticos en las histonas se traducen en biología.
En algún otro uso de la epigenética, probamos tejido cerebral que había sido digerido con LysC. Se extrajo una diversidad de fragmentos de péptidos, incluyendo, curiosamente, fragmentos de péptidos que corresponden a los movimientos de truncamiento de la cola. Pudimos notar dos acetilación. movimientos, así como mono, di y trimetil en este fragmento de péptido.
Ser notar el péptido generado a través de la condición LysC y el péptido generado a través de los movimientos de truncamiento de la cola, ocurriendo en el tejido mismo, es un paso vital para una mejor percepción de la biología y traducir estos datos en un fenotipo de vigilancia efectivo. y movimientos biológicos.
Ghaith Hamza es un científico senior de proteómica en AstraZeneca que estudia espectrometría de masas, proteómica, genómica y biología química de enfermedades humanas y percibe los mecanismos de las vías de señalización móvil.
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Apa
Bruker Daltonics. (2020, 16 de noviembre). Espectrometría de masas asistida por moldeo por afinidad para proteómica. News-Medical. Recuperado el 18 de noviembre de 2020 en https://www. news-medical. net/news/20201116/Affinity-Bead-Assisted-Mass-Spectrometry-for-Proteomics . aspx.
Mla
Bruker Daltonics. » Espectrometría de masas de moldeo por afinidad para proteómica». News-Medical. 18 de noviembre de 2020.
Chicago
Bruker Daltonics. » Espectrometría de masas de moldeo por afinidad para proteómica». News-Medical. https: //www. news-medical. net/news/20201116/Affinity-Bead-Assisted-Mass-Spectrometry-for-Proteomics. aspx. (consultado el 18 de noviembre de 2020).
Harvard
Bruker Daltonics. 2020. Espectrometría de masas asistida por masa a través de la afinidad por la proteómica. News-Medical, consultado el 04 de noviembre de 2020, https://www. news-medical. net/news/20201116/Affinity-Bead-Assisted-Mass-Spectrometry- para Proteomics. aspx.
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